簡(jiǎn)介
空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)作為解析基因表達(dá)空間分布的核心工具，其實(shí)驗(yàn)流程的規(guī)范性直接影響數(shù)據(jù)質(zhì)量與研究結(jié)論。本文從技術(shù)支持角度，系統(tǒng)梳理實(shí)驗(yàn)各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵參數(shù)、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案，為科研人員提供實(shí)操性指導(dǎo)。
技術(shù)方法和分類(lèi)
空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)主要分為基于測(cè)序和基于成像兩大類(lèi)：
（一）基于測(cè)序的方法
1. 工作流程：組織切片貼合帶空間條形碼的芯片，透化后釋放的mRNA與芯片上帶位置標(biāo)簽的引物結(jié)合，經(jīng)原位逆轉(zhuǎn)錄使cDNA帶上位置信息，測(cè)序后結(jié)合形態(tài)學(xué)得到基因空間表達(dá)圖譜。
2. 技術(shù)舉例
·10x Genomics Visium：芯片含 4 個(gè)捕獲區(qū)，每個(gè)區(qū)有5000個(gè)55 μm 直徑的spots，適用于多種組織的大面積分析。
·Slide-seq：用10 μm帶DNA標(biāo)簽引物的微球，分辨率高，利于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組空間定位。
·Stereo-seq：基于DNB芯片，實(shí)現(xiàn)高分辨率與厘米級(jí)大視野分析，適合大尺寸樣本。
（二）基于成像的方法
1. 工作流程：特異性探針與mRNA雜交，經(jīng)熒光標(biāo)記后原位成像，依據(jù)信號(hào)位置和強(qiáng)度確定mRNA空間分布，需通過(guò)ISH或ISS區(qū)分mRNA種類(lèi)。
2. 技術(shù)舉例
·MERFISH：多輪FISH結(jié)合獨(dú)特編碼，亞細(xì)胞分辨率下對(duì)大量基因成像，解析細(xì)微表達(dá)差異。
·seqFISH：序列化探針編碼與雜交輪回，可檢測(cè)上千基因，亞細(xì)胞分辨率，全轉(zhuǎn)錄組成像效果佳。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)
（一）樣本選擇與處理
樣本類(lèi)型：新鮮冷凍組織為理想樣本，F(xiàn)FPE樣本可使用但需特殊處理以提高RNA質(zhì)量。
樣本制備：新鮮組織需快速冷凍，F(xiàn)FPE樣本需脫蠟、抗原修復(fù)；切片厚度5-10 μm，平衡mRNA捕獲量與空間分辨率。
（二）技術(shù)選擇
基于實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫w空間分布分析且需大視野、高通量數(shù)據(jù)，選基于測(cè)序的技術(shù)（如10× Visium）；亞細(xì)胞水平研究特定基因，選基于成像的技術(shù)（如MERFISH）。
基于樣本特點(diǎn)：樣本量少選對(duì)起始量要求低的技術(shù)；復(fù)雜組織（如大腦、腫瘤）需高分辨率技術(shù)，簡(jiǎn)單組織可選低分辨率技術(shù)。
（三）對(duì)照設(shè)置
實(shí)驗(yàn)對(duì)照：陰性對(duì)照檢測(cè)背景信號(hào)，陽(yáng)性對(duì)照驗(yàn)證流程準(zhǔn)確性。
生物學(xué)重復(fù)：每組至少3-5個(gè)，確保結(jié)果可重復(fù)與有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
數(shù)據(jù)分析流程
（一）數(shù)據(jù)預(yù)處理
1. 基于測(cè)序數(shù)據(jù)
·讀取fastq格式數(shù)據(jù)，質(zhì)控后過(guò)濾低質(zhì)量reads。
·識(shí)別并校正空間條形碼，確?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)與位置正確關(guān)聯(lián)。
·比對(duì)reads到參考基因組，用STAR等軟件定量基因表達(dá)（以FPKM或TPM表示）。
2. 基于成像數(shù)據(jù)
·采集圖像，大面積樣本需拼接以保證對(duì)齊。
·增強(qiáng)圖像對(duì)比度、扣除背景噪聲，提高信號(hào)準(zhǔn)確性。
·識(shí)別信號(hào)點(diǎn)并定量，熒光信號(hào)需轉(zhuǎn)換為mRNA拷貝數(shù)或相對(duì)表達(dá)量。
（二）數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化
1. 全局標(biāo)準(zhǔn)化：調(diào)整樣本基因表達(dá)總量至同一水平，便于樣本間比較。
2. 分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化：使樣本相同分位數(shù)位置的表達(dá)值相等，校正分布差異。
3. 基于內(nèi)參基因：用表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因校正樣本間技術(shù)差異，需驗(yàn)證內(nèi)參適用性。
（三）空間特征識(shí)別與分析
1. 聚類(lèi)分析：結(jié)合基因表達(dá)與空間位置，用層次聚類(lèi)等算法聚合同類(lèi)細(xì)胞或區(qū)域，體現(xiàn)空間連續(xù)性。
2. 差異表達(dá)分析：用DESeq2等方法比較不同組的空間基因表達(dá)差異，篩選顯著差異基因。
3. 基因集富集分析：將差異基因映射到GO、KEGG等基因集，揭示涉及的生物學(xué)功能與通路。
4. 空間自相關(guān)分析：通過(guò)Moran's I等系數(shù)，評(píng)估基因表達(dá)的空間聚集或分散趨勢(shì)。
（四）細(xì)胞類(lèi)型注釋與空間定位
1. 結(jié)合scRNA-seq數(shù)據(jù)：利用scRNA-seq的細(xì)胞類(lèi)型特征基因，通過(guò)相關(guān)性或分類(lèi)模型注釋空間轉(zhuǎn)錄組中的細(xì)胞類(lèi)型。
2. 空間細(xì)胞分割與定位：高分辨率數(shù)據(jù)需分割細(xì)胞，用分水嶺算法等確定細(xì)胞位置，精確研究細(xì)胞互作與表達(dá)異質(zhì)性。
（五）數(shù)據(jù)可視化
1. 熱圖：展示基因在不同空間位置或樣本組的表達(dá)差異，直觀反映表達(dá)高低。
2. 氣泡圖：以氣泡大小和位置表示基因表達(dá)量與空間坐標(biāo)，同步展示表達(dá)與分布。
3. 空間點(diǎn)圖：將表達(dá)量以點(diǎn)繪在組織切片上，結(jié)合形態(tài)學(xué)理解表達(dá)與解剖結(jié)構(gòu)關(guān)系。
4. 三維可視化：整合基因表達(dá)與組織三維結(jié)構(gòu)，立體呈現(xiàn)基因分布，適用于三維數(shù)據(jù)或多維度信息展示。
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